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    Cap 1 Capping System

    货号
    M082
    售价
    询价
    规格
    10T/100T
    CAS号
  • 产品简介
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  • 产品信息

    货号

    名称

    规格

    GMP-M062-01A

    Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade

    500U

    GMP-M072-01A

    mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase, GMP Grade

    2500U

    GMP -S062

    SAM (32mM), GMP Grade

    0.5ml

    GMP-M062-01A

    Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade

    500U

    M062-YH01-01A

    Vaccinia Capping System

    500U

    M072

    mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase

    2500U/2500U×5

    M082

    Cap 1 Capping System

    10T/100T

    产品简介

          牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分,将7-甲基鸟苷帽结构(m7Gppp,Cap0)加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中,该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法,且帽结构与天然Cap 0结构完全一致,能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基(D1和D12)组成,D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能,D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能,它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的(图1)。
          由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶,Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。 mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到cap 0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置,从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。


         图1. 参与mRNA 加帽的酶促途径。Cap 0 结构 RNA 的产生需要牛痘病毒加帽酶:该酶兼具三磷酸酶、鸟苷转移酶和鸟嘌呤甲基转移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲基供体。一旦产生了Cap 0 结构,就可以通过2'-O-核糖甲基转移酶进一步修饰以产生Cap 1 结构。本图引自Michael Beverly , Amy Dell, Parul Parmar, Leslie Houghton et al (2016). Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 

         本体系可用于 IVT RNA 的加帽反应,使加帽反应在 1h 之内完成,效率接近 100%,并且保证正确的方向。IVT 推荐使用近岸蛋白质 T7 High Yield RNA Transcription kit(货号:E131)。 
    产品用途:
    体内或体外翻译前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端标记。 
    提高 RNA 的翻译效率; 
    改善 mRNA 在显微注射和转染后的表达。 
    应用实例:

    完整mRNA在细胞内表达GFP蛋白,加帽酶与帽类似物对比
    注意事项:   
    SAM:SAM 在pH 7-8,37°C条件下不稳定,需要在反应开始之前新鲜配置。为避免 SAM 降解,该工作液需要保存于冰上。 
    RNA:在加帽体系使用之前,应将体外转录反应产生的 RNA 进行纯化并溶解于 RNase-free 水中,不能将 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他盐溶液中。 
    RNA 二级结构:一些 RNA 转录本可能形成稳定的二级结构(同源二聚体和发卡结构),如二级结构发生在转录本的 5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热 RNA 可以去除转录产物 5´端的二级结构,如果转录产物的 5´端结构复杂,可以把加热时间延长至 10min,加帽反应时间可延长至 60min。 
    Cap 0-和 Cap 1-mRNA:Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之间的差异在 RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸(N1)是否具有 2'-O-甲基。在高等真核细胞中,该甲基化是天然加帽过程的一部分,Cap 1 结构提高了 mRNA 的翻译效率。


    Poly(A) 尾:如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴,可以使用近岸蛋白质 E. coli Poly(A) Polymerase(货号:M012)进行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在进行 RNA 转染实验前做纯化处理。 
    RNase Inhibitor:在配置反应体系时,可以加入 0.5 µl 近岸蛋白质 RNase 抑制剂(货号:E125),同时去掉等体积的 RNase-free水。 
    For research and manufacturing use only.