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    应用于重组蛋白纯化检测一一PA标签系统

          PA-Taq新型亲和标签系统(日本wako)是利用单克隆抗体(NZ-1)识别肽标签(GVAMPGAEDDVV)的高亲和性&高特异性的亲和纯化标签系统。PA tag 系统的亲和性特异性优于现有标签系统,抗体微珠可再生40-60次,可用于免疫细胞化学、免疫印迹和流式细胞术,是动物宿主细胞重组蛋白生产中的有效工具。

    ◆特点

    ● 通过树脂再生,降低运行成本

    ● 超高亲和性抗体,实现高回收率、高纯度纯化

    ● 在动物细胞表达系(HEK293T细胞、CHO细胞等)中,有效纯化蛋白

    PA标签系统是使用可识别肽标签(12个氨基酸残基)的单抗(NZ-1)。日本开发的亲和性纯化标签系统。

    NZ-1单抗对PA tag具有高亲和性和特异性,可应用于Western Blotting、细胞流式分析、免疫组化(ICC)。

      通过免疫沉淀,可纯化PA标签融合蛋白以及树脂再生。

    PA标签系统,可一步纯化高纯度PA标签融合蛋白。


    PA标签系统

    Fujii, Y. et al., "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.", Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).

    Fujii, Y. et al.
    新型亲和标签系统“PA tag”的应用方法~蛋白的纯化及检测~ 蛋白科学学会档案, 7, e075 (2014)

    PA标签表达载体案例


    载体

    表达模式

    宿主细胞

    MCS启动子

    pCAG

    瞬时表达

    灵长类(人、猴)、犬细胞等粘着细胞
      和啮齿动物细胞

    CAG

    ◆用PA标签从培养上清中亲和提纯的案例



    数据提供:大阪大学 蛋白研究所附属蛋白分析先进研究中心  

    分子创制学研究室 高木淳一老师,藤井勇树老师






    Protocol目的蛋白的纯化

     

    1.哺乳类动物细胞转染(HEK293T)
    转染处于40-60%融合状态的细胞
    培养基:D-MEM, 5%FBS

    2.回收培养上清和吸附蛋白树脂
    转染48-72小时后,回收约420 mL培养上清,加入8 mLPA标签抗体琼脂糖珠,混合2小时(2-10℃)

    3.树脂回收
    50 mL的纯化柱。回收步骤2)中的琼脂糖珠

    4.树脂洗涤
    加入珠4倍量的TBS 缓冲液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl),清洗5

    5.PA标签肽从树脂中竞争性洗脱
    加入经1×TBS溶液, pH 7.5溶解过的PA 标签肽(终浓度0.1 mg/mL),体积量需为珠的一倍,

    然后分10次回收PA标签融合蛋白X

    6.SDS-PAGE
    样品量
    c. sup5 μL, flow through5 μL, wash5 μL,
    肽洗脱(1-10):各10 μL

    可纯化PA标签融合蛋白X且不依赖PA标签。→可实现极高纯度的亲和纯化。

     

    ◆通过PA tag降低背景的方法

    M: Marker
    I: input 100ng
    P: 纯化前样品
    1: wash片段①
    2: wash片段②
    3: wash片段③
    4: wash片段④
    5: wash片段⑤
    6: wash片段⑥
    7: wash片段⑦
    8: wash片段⑧
    9: wash片段⑨
    10: 酸洗脱①
    11: 酸洗脱②
    12: 酸洗脱③
    13: 酸洗脱④
    14: 酸洗脱⑤

    20 mL的昆虫细胞溶解液中加入蛋白Z,使其浓度变为1.0 mg/L后,添加200 μLPA标签抗体琼脂糖珠,4℃温度条件下,搅拌3小时。

    分别用不同浓度的TBS溶液(0.15 M0.5 M1.0 M NaCl)进行调整,用琼脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7),室温条件下平稳震动5 min

    离心后回收上清,用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和处理。

    SDS-PAGE后进行银染,比较去除污染蛋白之后,不同浓度下的结果。

     

    ◆使用案例:Western Blotting