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    Western blot的实验技巧

    Western blot的实验技巧

           Western blot实验看似简单,但流程又很繁琐。很多同学往往做了很长时间的实验之后,却得不到理想的实验结果,甚是苦恼。其实,Western blot实验是有很多注意点和实验技巧的,小编今天给大家整理了一些非常关键的实验事项:

    蛋白提取

    蛋白提取是实验的第一步,也是最重要的一步,很多实验结果不好往往是由于蛋白提取出现了问题(但是很多同学却忽视了蛋白提取质量对实验结果的重要性)。以下几个因素是经常导致WB结果不理想的原因:

     蛋白提取的裂解液中,目的蛋白含量太低

    一些蛋白在组织中的蛋白含量很低(例如转录因子等核蛋白,GPCRCD分子等膜蛋白),如果提取蛋白的时候没有做到富集,往往后续WB显色的时候会导致背景很脏,甚至导致白板的出现。这时候需要专门的蛋白富集提取方法来提取蛋白,例如相对于全细胞或全组织裂解物来说,核表达蛋白在细胞核裂解物总蛋白中占有相当大的比例,这样凝胶条带中可以载入更多的目的蛋白。另一个优点是排除了杂质成分潜在的交叉反应。浓缩使信号最大化(例如检测核蛋白要用核裂解物)。



    如上图结果所示,使用特定的蛋白提取试剂盒提取蛋白,可以有效的富集特定细胞组分,保证目的蛋白的上样量。

    注:实验中使用GAPDH(M20006)分析细胞浆蛋白提取物,使用ATPase(T40109)分析细胞膜蛋白提取物,使用Histone(P30266)分析细胞核蛋白提取物。

    膜蛋白产品提取试剂盒货号:A10008,核蛋白产品提取试剂盒货号:A10009


    ★ 蛋白提取后出现降解

    在蛋白质的提取过程中,蛋白酶在细胞或组织裂解后释放,降解蛋白质样品,从而降低蛋白质样品的量。这样往往导致后续实验中检测不到目的蛋白或蛋白降解带明显出现。为防止蛋白质被蛋白酶所降解,要加入特异性的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白酶活性。很多同学在实验过程中也加入了蛋白酶抑制剂,但是为什么还会出现蛋白降解呢?主要原因是很多同学往往只加入了一种蛋白酶的抑制剂,但是蛋白酶是有非常多种类的,每一种蛋白酶均需要一种特定的蛋白酶抑制剂来抑制其蛋白酶活性。所以为了防止蛋白降解,需要加入各种蛋白酶抑制剂。

    最方便的做法是购买现成的Cocktail形式的蛋白酶抑制剂,这种蛋白酶抑制剂是将常用的数种蛋白酶抑制剂混合到一起,制备成了即用型的试剂产品,用起来很是方便。

    Abmart提供了一款Cocktail形式的蛋白酶抑制剂,可以有效地防止蛋白提取过程中的蛋白降解问题。A10004200X 蛋白酶抑制剂复合物(200X Protease InhibitorCocktail)【同Sigma P1860】。

    电泳转膜

    对于较大分子量的蛋白(大于100 kDa),电泳转膜这个步骤是很容易出现问题的,主要是包括以下几个方面:

    1. 对于大蛋白而言,其在凝胶电泳分离迁移较慢,而从凝胶转出也非常慢,因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶,8% 或更低,但因低浓度的胶非常易碎,所以操作时需十分小心。

    2. 大蛋白易在凝胶里形成沉淀,从而影响转膜。转膜时在电转移缓冲液加入SDS 至终浓度0.1%,避免出现这种情况。甲醇易使SDS 从蛋白上脱失,因此相应降低甲醇的浓度至10% 或更低,以防止蛋白沉淀。

    3. 降低电转移缓冲液中甲醇的比例,这样可以促进凝胶的膨胀,更易于大蛋白的转出。

    4. 只有使用硝酸纤维素膜时,甲醇才是必需的。如果是PVDF膜,甲醇可以不必加入电转移缓冲液中,但转膜前PVDF 需用甲醇活化。

    5. 选择湿式,4℃ 转膜过夜,以取代半干式转膜。

    这里,同学们需要注意:很多同学习惯使用预染marker判断转膜是否成功。该方法很是便捷,但是却无法判断每个泳道的转膜情况和是否有气泡污染。所以最好方法是使用丽春红染色QC转膜质量

    为检测转膜是否成功,用TBST 洗膜,然后用丽春红染色,室温下震荡5分钟。然后将膜浸泡在水中直至水变清且出现蛋白条带。观察膜上的条带是否清晰,各分子量条带均可见,无明显白色空斑(气泡导致)。

    TBST 或水重复洗膜直至膜完全脱色,PVDF 膜需用甲醇活化后再用TBST 洗,然后进行后续实验操作。

    10*丽春红贮备液:2% 丽春红S 溶于30% 三氯乙酸和30% 磺基水杨酸,震摇混匀。(或者购买现成的10*丽春红贮备液,货号: A10010

    一抗孵育/二抗孵育

     一抗稀释液

    为防止实验结果的背景比较脏,最好使用封闭液来稀释一抗,这样可以避免一抗可能与封闭液有交叉反应。

     使用错二抗

    有些抗体是小鼠抗体,有些抗体是兔子抗体,均需要使用对应的二抗来显色,用错了就会导致白板。特别是很多时候希望一抗和内参抗体同时孵育,使得目的蛋白检测和内参调平一步到位。但是很多时候是一抗是兔多抗,内参是小鼠单抗,一旦大意疏忽,就会导致实验出错。

    Abmart推出了一款“防错二抗”(鼠兔通用二抗),一管抗体解决所有问题,让实验变得很轻松。

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