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    解决免疫共沉淀(Co-IP)中的抗体轻重链污染问题

    解决免疫共沉淀(Co-IP)中的抗体轻重链污染问题

    1.    免疫共沉淀-互作研究经典方法

    免疫共沉淀(Co-ImmunoprecipitationCoIP)是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法,常用于发现蛋白的互作网络、鉴定两蛋白的互作关系。

    CoIP的设计原理是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可以将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来(常说的“pull-down”),进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。

    CoIP的特点可以概括为两点,第一是天然状态蛋白,第二是蛋白复合物。

    大致流程如下图所示:


    2.哪有那么简单

    上面讲了原理和流程,看起来很好理解。但研究中往往不像理论那么顺利。

    在做CoIP实验过程中往往会遇到目的蛋白与抗体轻链(25kDa左右)或者抗体重链(55kDa左右)的分子量接近的情况,导致IP-WB检测时无法判断目的蛋白条带(如上图)。

    如何解决这种问题,困扰了非常多的小伙伴。

    3. 问题的根源

    其实产生抗体轻、重链条带污染的主要原因是,我们上二抗的时候,PVDF膜上有两种一抗:

    1)用于CoIP的一抗脱落后跑电泳并转印到膜上(上图红圈所示)

    2)IP-WB时加入的一抗(上图红色箭头对应的一抗)。

    二抗同时识别上面两种一抗,导致除了目标条带(红色箭头)外,还产生抗体的轻链和重链条带(黑色箭头)。

    4. 解法

    要解决该问题主要就是处理掉图中的轻、重链条带。

    那我们知道做WB要有条带需要2个要素:目标蛋白、抗体及发光基团。

    解法就是分别解决这3个要素,任意一个要素解决了问题就解决了。

    1)  Co-IP抗体共价偶联到磁珠或者Agarose——这样在洗脱的时候,抗体就不会被洗到CoIP产物中去。

    (产品推荐:A10003 NHS-Activated Magarose Beads,或者M2001X系列Tag-Agarose beads产品);


     2)  IP-WB检测一抗直接标记HRPWB实验过程中不使用二抗——这样就不会发生二抗识别CoIP产物中一抗抗体。

    (产品推荐:M200系列HRP标记标签抗体);

     3)  使用一款只识别天然构象抗体的二抗——由于WB过程中,CoIP产物中一抗抗体变性,该二抗不会识别产生条带。

    (产品推荐:AbSmart系列二抗);

    上述3种方法中:购买共价偶联好的Tag-Agarose beads或者HRP标记的标签抗体,使用起来很方便,作为实验首选。

    但是绝大多数一抗是没有HRP标记的或者共价偶联beads的,所以很多实验室在做内源性蛋白Co-IP实验时就会很烦恼,这时候使用避免抗体轻重链的AbSmart系列二抗,就可以有效地解决这类问题,作为内源性蛋白的Co-IP实验的首选。

    另外如果Co-IP之后,需要质谱鉴定互作蛋白或修饰时,为了排除质谱检测时抗体的干扰,可以选择使用NHS- Activated Magarose Beads来共价偶联一抗,然后做CoIP实验将产物进行质谱检测,这样可以大大提高质谱检出蛋白的数量和修饰位点的灵敏度。

    下面给大家分享一个实验结果案例:


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    1.Tag-Agarose beads产品

    M20012:Anti-Myc-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

    M20013:Anti-HA-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

    M20014:Anti-GFP-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

    M20018:Anti-DYKDDDDK-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

    2.HRP标记的tag产品

    M20019: Anti-Myc-Tag Antibody (HRP Conjugated)

    M20020: Anti-His-Tag Antibody (HRP Conjugated)

    M20021: Anti-Ha-Tag Antibody (HRP Conjugated)

    M20022: Anti-GFP-Tag Antibody(HRP Conjugated) 

    M20025: Anti-GST-Tag Antibody(HRPConjugated) 

    M20026: Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody(HRPConjugated) 

    3.避免抗体轻重链二抗产品

    AbSmart-M21004:Goat Anti-Mouse IgG HRP(避免重链)

    AbSmart-M21005: GoatAnti-Mouse IgG HRP(避免轻链)

    AbSmart-M21006: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免重链)

    AbSmart-M21007: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免轻链)

    4.共价偶联Agarose产品

    A10003: NHS- ActivatedMagarose Beads

    注意:

    有同学反馈说使用共价偶联好的Tag-Agarose beads产品,在做CoIP-WB检测的时候,也会出现抗体轻重链。

    详细了解实验流程后,发现是由于CoIP实验的最后一步(互作蛋白洗脱步骤)操作错误导致。

    即很多同学在3PBST洗涤之后,直接就加入WB Loading buffer进行煮样,然后就进行SDS-PAGE上样了。这样操作会导致共价偶联的抗体被分离下来,在WB中出现抗体轻重链的条带。

    正确的操作应该是:1. 3次PBST洗涤之后,加入50-100ulPH2.5-3.0的甘氨酸溶液(加入体积根据实验需求自行调整);2. 震荡混匀,静置30-60s,离心取上清(磁珠用磁力架);3. 上清中按照体积比1:10(中和液/甘氨酸)加入中和液(中和液为PH9.0Tris溶液);4. 后续在上清液中正常加入WB Loading buffer操作即可。

    为了方便大家实验操作,Abmart为大家提供了配置好的洗脱液和中和液产品(货号T10007),该产品也可以作为ProA/G产品的洗脱液和中和液。如果是使用Flag抗体进行CoIP实验,可以使用3*DDDDK多肽(货号T10004)进行洗脱,该产品针对非共价偶联的Flag抗体进行的CoIP实验,一样可以起到避免抗体轻重链污染的问题。