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    细胞系基因敲低技术实验指导

    细胞系基因敲低技术指导

    简介(INTRODUCTION)
    目前实验室常用的基因敲低技术有三种,分别是shRNA,siRNA和CRISPR/Cas 系统;shRNA和siRNA都是在RNA水平上降低蛋白的表达,CRISPR/Cas是在DNA水平上降低蛋白的表达;shRNA与siRNA的加工方式相同,在细胞核表达后被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中,在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后,它们识别mRNA占有互补序列,导致mRNA降解。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,它可以将入侵的噬菌体和外源质粒DNA片段整合到规律成簇的间隔短回文重复序列crisper中,随后被内切酶切割形成crRNA,通过碱基互补配对形成PAM互补区,指导cas9内切酶来对DNA进行定点切割,从而达到在DNA水平上降低蛋白表达的目的。
    材料(MATERIALS)
    o  试剂(REAGENTS)
    慢病毒包装质粒、LB、氨苄青霉素、Amp板子、小抽试剂盒、完全培养基、减血清培养基(Opti‐MEM)、lipo2000、嘌呤霉素、细胞培养皿(10cm)、24孔板、12孔板、6 孔板、9孔板、0.45um滤膜  
    o  试剂准备(REAGENT SETUP)
        LB:已经灭菌的新鲜LB(无抗);
    氨苄青霉素(1000X):用ddH2O配制成终浓度为100mg/mL,用0.22um滤膜过滤后  分装;嘌呤霉素:根据需要的浓度自行配制。
    o  器械(EQUIPMENT)
        EP管、冻存管、离心机、细胞培养箱、-80℃冰箱
    实验步骤(PROCEDURE)
    shRNA敲低细胞系►预期时间消耗:两个星期间断性实验
    1.细胞嘌呤霉素浓度确定实验:
    a.24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜;
    b.准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);
    c.细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;
    d.约2-3天更换新鲜的筛选培养基;
    e.每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间;
    f. 最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
    2. shRNA库中查找有没有所需基因的shRNA,一般会有4-5条
    3.拿到shRNA后加入LB摇菌小抽后继续转化后中抽,得到浓度较高的质粒;
    4.第一天晚上接种 293T 于6孔板,每孔接种70-80%(1×106个),并加入2ml培养基,每种 shRNA对应一孔;
    5.第二天早上转染质粒:2ug shRNA, vsv-g 1ug, gag 2ug, Rev 2ug,lip2000 18ul;
    6.第三天早上弃上清,加入1ml完全培养基;
    7.第四天吸出含病毒的培养基上清液,4000rpm/min 离心 5min,吸上清用0.45um滤膜过滤后放入无菌的EP管中,-80℃保存(可保存六个月),也可马上使用;
    8.第三天的时候可同时将目的细胞接12孔板,密度大约为5X105/ml;
    9.第四天将12孔板中培养基上清去除,加入病毒上清1ml,感染6h后补加1ml新鲜培养基;
    10.第五天更换筛选培养基,第七天换液(利用含有嘌呤霉素的培养基筛选)等细胞长满后将细胞移至6孔板,继续加入嘌呤霉素维持,此为瞬敲细胞系。
    11.稳敲细胞系(筛选时嘌呤霉素浓度不变)是将瞬敲得到的细胞稀释成10 cells/ml,转移至96孔板中培养,每孔100ul(大约每孔1个细胞);
    12.18-24h后,观察每孔的细胞数,将只有一个细胞的孔做上标记;
    13.观察做标记的孔形成的克隆数,只形成1个克隆的被认为是单克隆;
    14. 持续观察确认孔中克隆数,当96孔板中的单克隆达到较高密度时,转移至12孔板培养;
    15.细胞在12孔板中达到较高密度时,转移至6孔板中继续培养,同时取少量细胞鉴定效果(western blot 或QPCR);
    16.确认表达后,将单克隆转移至10cm培养皿中培养,一般需要2-4周细胞才能达到较高密度;
    17.冻存细胞(冻存液不含抗生素);
    18.稳转细胞系建立以后,可降低抗生素浓度(如降成原来的一半)。
    ▲关键步骤:不同的细胞种类对于接板时细胞数以及抗生素的浓度的选择不同,需要自己摸索或者请教师兄师姐。
    siRNA敲低细胞系 ►预期时间消耗:两个星期间断性实验
    (以下步骤所有的量和浓度都是以孔为基础)
    1.转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,使转染时的细胞密度能够达到 30~50% (不同细胞生长速度不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),请使用无抗生素的培养基;
    2.对于每个转染样品,按照如下操作准备 lip2000‐siRNA 混合物:
    a. 稀释转染试剂 lipo2000:使用前,将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀,然后取 2ul,用 100ul 不含血清的 Opti‐MEM 稀释,轻轻混和,室温孵育 5min; 
    b.稀释 siRNA:用 100ul Opti‐MEM 稀释 40pmol 的 siRNA,轻轻混和;(对于 stock 浓度为 20uM 的 siRNA,加 2ul 即可)
    c.稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后,与上述(b)稀释好的siRNA 轻轻混和,室温培养20min 以形成siRNA‐lipo2000混和物,溶液可能会有浑浊,不过不会影响转染。 
    3.将 siRNA‐lipo2000 混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中,轻轻摇晃,使之混和;
    4.将培养板置于 37 ℃的 CO2 培养箱中培养至检测时间(24~96h)。沉默效率的检测一般建议的时间为 24~72h。
    ▲关键步骤:转染操作完成,经过 37℃培养 4~6h后,可以将孔里含有 siRNA‐lipo2000 混合液的培养基移去,更换新鲜培养基,这样也不会影响转染的效率。注意:如果转染时使用的是不含血清的培养基(即血清饥饿的条件下进行转染),4~6h 后必须换成完全培养基(含血清、含抗生素),以确保细胞生长。
    CRISPR/Cas9敲低细胞系 ►预期时间消耗:两个星期间断性实验
    1. 通过软件设计基因的sgRNA并送到公司合成;
    2. 拿到的sgRNA(上游,下游)需要复性,体系: sgRNA(F 100μM) 2μl,sgRNA(R 100μM)2μl ,NEB buffer2(sigma)2μl,ddH2O 14μl  95℃放置5min,然后自然冷却至室温;
    3. cas9载体质粒酶切,体系:cas9载体质粒5μg,bsmb1内切酶3μl,FastAP 3μl,buffer
    6μL ,ddH2O补齐至60μl在37 ℃放置30min,然后0.8%核酸胶跑胶,可以看到两条带,分子量大的那条胶回收;
    4. cas9质粒酶切后回收产物和复性的sgRNA连接,使用T4连接酶,用量和步骤见T4连接酶说明书,连接产物转化,挑点摇菌,鉴定后测序抽质粒;
    5. 得到的质粒与shRNA敲低方式相同。
    ▲关键步骤:酶切需要彻底,并且需要设计出具有敲除效果的sgRNA。
    针对性建议(TROUBLESHOOTING)
    1.    细胞系敲低时细胞状态不稳定会在感染时大面积死亡,所以无论是293T还是目的细胞状态都需要非常良好;
    2.    对于抗生素浓度以及病毒滴度最好能事先做一下预实验确定;
    3.    重复检测具有敲低效果的细胞系需要马上冻存保种避免重新筛选,这一点很重要;
    4.    慢病毒包装得到的病毒最好现用,放于-80℃冰箱的病毒上清应避免反复冻融。