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    PMA佛波肉荳蔻醋酸&I钙离子载体离子霉素与流式检测

         活化细胞的机制——用于流式检测PMA&Ionomycin

           流式胞内染色中最常用的活化细胞方法就是用一定浓度的PMA和Ionomycin刺激细胞4-6小时,同时加入蛋白转运抑制剂(通常是monensin或brefeldin A)阻止高尔基体将新分泌蛋白运输到细胞外,从而达到通过流式来检测细胞因子的目的。今天,就来简单的聊一聊PMA和Ionomycin刺激细胞活化的机制。

           离子霉素是一种有效且有选择性的钙离子载体试剂 (1,2)。这种分子作为能动 Ca2+ 载体发挥作用,并通过直接刺激存储调节的阳离子进入生物膜增强 Ca2+ 内流 (3)。微摩尔水平的离子霉素会激活 Ca2+/钙调素依赖的激酶和磷酸酶来刺激基因表达 (4)。在人 T 细胞中,离子霉素会诱导磷酸肌醇水解,并激活 PKC 以介导 T 细胞激活 (5)。人 B 细胞用离子霉素处理会诱导钙依赖性核酸内切酶的激活,并导致细胞凋亡 (6)。牛主动脉内皮细胞 (BAEC) 用离子霉素处理会诱导 eNOS 在Thr495位点的快速去磷酸化,并介导 eNOS 激活 (7)。常常与佛波肉荳蔻醋酸PMA联合刺激多种免疫细胞,以产生细胞因子。同时也与蛋白转运抑制剂如布雷非德菌素A(Brefeldin A),莫能霉素(Monensin)联合使用,抑制细胞因子外分泌,保留在细胞内以准确分析细胞因子表达水平。

          Phorbol 12-myristate 13-acetate( 佛波肉豆蔻醋酸) ,简称为PMA 也称为TPA CAS NO 16561-29-8,一种广泛用于体内外实验的佛波酯(phorbol ester )类PKC激舌剂。PMA可抑制Fas诱导的细胞凋亡,同时又可诱导HL-60细胞的周亡发生。PMA是一种强效的肿瘤促进剂能够诱导小鼠皮肤瘤生成。常常与离子霉素Ionomycin ( 货号WU074 )联合刺激多种免疫细胞,以产生细胞因子。同时也与蛋白转运抑制剂如布雷非德菌素A( Brefeldin A ,货号WU045) ,莫能霉素( Monensin 货号: WU057) 联合使用抑制细胞因子外分泌,保留在细胞内以准确分析细胞因子表达水平。

           激活Protein kinase C (PKC)
    在细胞内,Protein kinase C (PKC)的激活,可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致多种蛋白的表达,进而引起细胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Calcium(Ca2+)的共同作用下而激活。PMA是一种DAG的模拟物,而Ionomycin是Ca2+的转运剂,可将细胞器内的Ca2+转运到胞浆,所以PMA和Ionomycin的共同作用可以激活PKC,从而引起一系列的下游反应。
    PMA的中文名称是豆蔻酰佛波醇乙酯(也称TPA),英文全称是: Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA),或12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate(TPA),是一种最常用的佛波酯(phorbol ester),
    Ionomycin
    Ca2+在细胞内普遍存在,控制着细胞内很多生物过程,包括细胞增殖、分化、分泌细胞因子等,这些生物过程的发生和细胞内的Ca2+浓度密切相关(如下图所示)。离子霉素(Ionomycin)作为一种钙离子载体,可提高胞浆内游离Ca2+的水平,活化依赖Ca2+/钙调蛋白生物途径。所以,如前面所说PMA和Ionomycin的共同作用可以起到激活细胞的作用。
    PMA&Ionomycin与流式检测

    1.PKC属于下游的TCR信号,只会诱导T细胞活化和增殖,因此,PMA和Ionomycin的刺激后T细胞的活化和增殖能力改变,然而并不会改变T细胞的分化状态。

    2.TCR信号的活化会激活所有的T细胞亚群,所以当T细胞不同亚群的增殖速率不一样时,各个T细胞亚群的原始比例就会因为刺激而发生改变。但是这种假说很难加以证明,因为在没有刺激的情况下,胞内因子很难被检测到。

    3。因为TCR信号是很强很基础的刺激,研究者更加倾向于认为所有的T细胞亚群在TCR信号刺激下的增殖速度是一致的,所以在在体外进行PMA和Ionomycin刺激后,仍然反映的是T细胞亚群在生物体体内的原始比例。
    了解了PMA和Ionomycin刺激细胞活化的机制,再来探讨流式胞内染色中如何合理的使用刺激剂对细胞进行刺激,已达到检测目的。对于小鼠的淋巴细胞或人的PBMC样本中的一些胞内因子(如IFN-γ、IL-2、TNF-α等),直接用PMA和Ionomycin刺激培养一段时间后,就可以用流式胞内染色的方法进行检测。但是对于有一些细胞因子,比如mouse的IL-4等,正常情况下直接用PMA和Ionomycin刺激培养4-6小时后是很难检测到IL-4的信号,对于这些胞内因子的检测是需要实验人员设计合理的刺激方案进行刺激。关于检测不同胞内因子的刺激方案。

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